2018年10月23日
 
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浅谈抗体生产细胞株质量控制
作者:中国生化制药工业协会 日期:2017-10-20

1.简介

利用稳定细胞系生产生物制品时,细胞系的质量直接决定了产品的质量属性及工艺开发的难以程度。细胞系的稳定性使得后期工艺放大更简单易行;基因重组方式的最优化可以大大减少下游纯化工艺的开发时间和难度。稳定细胞库的构建以及稳定性考察保证了重组生物制品一旦上市即可以有持续稳定的产品供应。而符合药典规定的细胞库既是产品上市的必要条件,同时也是保证产品使用安全的重要保证。

2.细胞株来源

目前常用的生产细胞株为中国仓鼠卵巢癌细胞(Chinese Harmster Ovary cellCHO)。原始细胞株经过几十年的发展和改进,目前主流的CHO来源的细胞株主要有三种:CHO -K1(基于GS体系)CHO DG44(基于DHFR缺陷型的细胞系)CHO-S(通过驯化筛选生长速度快的CHO细胞得到)

CHO细胞为基础,目前发展成熟的工业细胞培养平台有三个:LonzaGS systemSigma-AldrichCHOZNThermoFisherCHO-S。它们的特点如下:

(1) GS SystemLonza 2012年推出的CHO K1SV GS-KOCHO K1的基础上敲除GS基因得到的新一代的CHO K1细胞系。

(2) CHO ZNSigma-Aldrich2011年推出了CHOZN DHFR-/-CHOZN GS-/-。其中CHOZNGS-/-是利用ZFN技术敲除GS基因得到的新一代的CHO K1细胞系。

(3) CHO-SThermoFisherCHO S的基础上开发出三种不同类型的亚细胞株:FreeStyle CHO S cellscGMP CHO SExpiCHO S

3. 稳定细胞株构建方法

重组细胞株的构建流程为:转染-细胞系筛选-单克隆化-克隆筛选-工艺优化(确定生产细胞株)。成功构建的重组细胞株要求基因序列正确、表达正确、表达产物结构正确及产物应具有符合预期的生物活性。

3.1. 转染

        细胞稳定转染的方法有多种,包括化学转染法(脂质体转染),物理转染法(电穿孔转染)和病毒载体法(逆转录病毒、慢病毒、腺病毒)等。

脂质体:脂质载体与质粒结合,通过膜融合或细胞內吞作用进入细胞内。电穿孔转染:目的基因整合位点位于非核基质区,转录活性低。病毒转染:目的基因整合位点位于核基质区,转录活性高。

在整个稳定细胞株的构建过程中,转染为主要的限速步骤。虽然如今可以选择的转染方法有很多,但电穿孔转染由于其使用门槛较低,仍是主流的转染方法。同时该方法的弊端也十分明显,即电转过程的不可控,转染效率低等。通过优化载体构建策略、转染方法和过程参数的方法,以达到提高细胞转染效率和产物表达质量的目的,进而形成稳定的重组细胞构建平台。

3.2. 单克隆化

  由于不同亚克隆的细胞株同时生长时容易形成竞争抑制导致产品稳定性下降,同时也会造成生产过程的稳定和可控性下降,近今些年来监管部门对于细胞的单克隆源性提出了要求。

由于细胞在复制过程中会发生随机突变,因此完全的单克隆是不可能实现的,所以验证单克隆的方法很重要,是否有充分的证明文件或方法是非常重要的。此外,建立综合的控制策略也是非常重要的。通过现有的技术手段得到的单克隆并不具有遗传同质性(genetic homogeneity)而是具有同源性(clonally-derived)的细胞群体,此时可以保证产品质量合格并且可以保证生产的一致性。

现有的单克隆方法有很多,但如何通过组合不同方法来提供充分的细胞单克隆源性的证据十分重要,目前公认的方法有:

1)两轮有限稀释,细胞密度小于0.5 cellswell(传统方法,可接受);

2)一轮细胞密度小于0.5的有限稀释,加上直接的细胞图像证据;

3ClonePix加直接的细胞图像证据;

4FACS加细胞图像证据;

5FACS加一轮密度合适的有限稀释;

6)两轮方法成熟稳定的ClonePix

如果无法提供足够的单克隆源性的证据,无法确定细胞是否为单克隆,此时可以通过以下方法来证明细胞的单克隆源性,但是不能通保证可以通过审批。

1)通过FISH检查插入位点;

2)亚克隆分析:基因型(利用FISH检测表达框),核型和细胞表型(细胞倍增时间,产物产量和产品质量分析)。

4. 细胞库研究和建立

4.1. 细胞库建立

根据2015版药典的规定,用于生物制品生产的细胞株应建立三级细胞库:细胞种子库(PCB)、主细胞库(MCB)和工作细胞库(WCB)。

细胞从复苏至冻存的过程应尽量缩短,传代过程中尽量不弃掉细胞培养液。为保证一致性,分装之前应保证所有细胞都在同一容器内混匀,且一次分装完成。同时,应建立细胞冻存的标准操作规程,保证不同批次的WCB细胞株具有相同的遗传性状和表达特征,以此保证后期培养、纯化和分析方法的可重复性。

4.2. 细胞库的管理

种子细胞库和工作细胞库应分别存放,每个库应在生产设施内至少2个不同的地点或区域存放,每种细胞库应分别建立台账并详细记录一下内容:存放位置;容器编号;分装及冻存数量、取用记录等。细胞库中的每支细胞应具有一下信息:细胞株名称;代次;批号;编号;冻存日期;贮存容器编号。

4.3. 细胞库质控

2015版药典的要求对细胞库进行质量检测,其中着重关注的检测指标为支原体和病毒检测。

支原体对细胞的生长一般不会有明显的影响,但有时会出现细胞生长变慢的情况,此外,支原体的存在会大量消耗培养基中的营养成分,从而造成细胞蛋白合成障碍。在细胞培养过程中如果污染了支原体是较难发现的。

病毒的存在会造成产物中含有病毒及其相关蛋白,这会导致应用于病人时产生过敏反应,影响药物质量安全。

综上,从种子复苏、扩增直至冻存建库的过程中均需严格按照GMP的要求,严格控制培养环境、实验操作的无菌,从源头杜绝一切可能影响细胞库安全性及质量稳定性的因素。

4.4. 细胞库稳定性

1)传代稳定性

群体倍增时间(Population doubling Levels,PDL)为指细胞在培养条件下生长时其数目倍增所需的时间。最高传代次数的确定取决于初始细胞数量、生产体积、生产结束时的细胞浓度及群体倍增时间确定。以初始细胞数1E7、最终生产体积2万升、最终细胞浓度2E7cells/ml为例,细胞需要倍增约25次。最高传代次数为倍增次数的2~3倍,即50~75PDLs1PDL≈24h,即细胞需要连续培养约75天。实际培养可略微提高传代时间(如80天)。考察细胞在这80天的培养过程中的核型、基因拷贝数、产物表达量及质量等参数的稳定性。

2)冻存稳定性

  为验证深低温冷冻操作的可靠性,应对深低温冷冻的细胞抽样复苏,检查冷冻后的活率并记录。冻存稳定性考察应包含细胞容器的完整性和细胞活率,考察时间应涵盖冻存有效期,考察的批次可以由本部门自己决定,原则上应能够获得足够的数据以供趋势分析。

5.    小结

  生物制品的研发周期普遍较长,从前期靶标的筛选直至最后药品上市耗费几年甚至是十几年都是有的,而有关细胞株的构建及建库等工作一般都是在项目早期就已经完成,那么如何保证细胞在整个研发周期甚至药品上市后的几十年的稳定性?这就要求我们从分子的设计、重组细胞株的构建、细胞库的建立和后期稳定性考察过程都要进行充分地研究及验证工作,将细胞株的不稳定因素降至最低。

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